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是一种一年生或多年生 的草本植物

更新时间:2019-10-04 17:08点击:

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  藜草花粉主要变应原的分离和鉴定中文摘要 藜草花粉作为夏秋季一种重要的吸入性过敏原,可引起支气管哮喘 和其他的变态反应性疾病。目前临床上主要是使用此花粉浸液进行特异 性的诊断和治疗,但由于花粉粗提物中含有多种变应原成份和其他一些 非致敏物质,用于人体可引起多种副作用,并降低诊断和治疗的特异性。 本课题以藜草花粉作为研究对象,分析其变应原成份,筛选鉴定出藜草 花粉主要变应原,以期为改进以上所用制剂,阐明支气管哮喘的发病机 制提供一定的基础。 嫦规制备藜草花粉浸液,同时收集藜草花粉过敏哮喘病人、非藜草 花粉过敏的哮喘病人及健康成人血清,确立生物素亲和素.酶联免疫吸附 分析法(BA—ELISA)检测藜草花粉变应原与血清IgE的反应条件。使用 SephadexG-100凝胶(直径1.6cm柱长95cm),以0.05mol/L,DH7。4 磷酸缓冲液洗脱,流速5ml/hr/管,经紫外光吸收法监测蛋白质洗脱情况 并计算蛋白质回收率。收集各洗脱部分,用前述已知血清经BA-ELISA法 检测各洗脱组份的生物学活性,筛选出与阳性血清反应阳性率最高的部 分,并用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该组份蛋 白质纯度,最后通过免疫印迹法(Immunoblotting)从阳性组份中筛选出 藜草花粉主要变应原,结合SDS-PAGE确定其分子量大小。 天然藜草花粉浸液浓度1.7lmg/ml,浓缩后以最适上样体积1.5ml, 最适上样浓度11.4rog/ml上样,经Sephadex G-1 00分离后形成两个明显 的洗脱峰。收集各峰技峰谷部分(PTl、PT2、PT2’、PT3和PT3’)进行BA-ELISA 检测,FT2、PT2’和PT3部分均可与阳性血清反应,再经个别阳性血清的 筛选,PT2+PT2’混合部分具有最高的阳性率,可与80%(8/10)的阳性血清 反应。SDS-PAGE结果显示藜草花粉浸液中含有10余种蛋白质,其分子量 大小介于14—43kDa及66—97kDa之间,PT2+PT2’部分主要含有2条分子量 在66—97kDa的蛋白质成分,PT2+PT2’部分的样品未经变性的电泳结果与 变性样品电泳结果相似,提示样品所舍蛋白质不合有亚基组成。用免疫 印迹法研究发现,在PT2+PT2’部分中有一个分子量约为68kDa的蛋白质 可与83.3%(5/6)对藜草花粉过敏的哮喘病人血清反应,提示此蛋白是藜 草花粉的主要变应原。 综上所述j藜草花粉是由10余种蛋白质组成,分子量大小在14-43kDa及66—97kDa之间,以SephadexG-i00能将这两部分较好地分开(PT2, PT3),其中含较大分子量蛋白的PT2组份具有较高的生物学活性,从中 筛选并鉴定出藜草花粉所含有的一种主要变应原,此变应原分子量约为 68kDa,是一个不合亚基组成的蛋白质。 关键词 支气管哮喘.藜草花粉.主要变应原、凝胶过滤层析i生 物素亲和素一酶联免疫分析法,十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 免疫印迹法 IsolationandIdentificationofthe majorallergen Chenopodiumalbum pollen Abstract Chenopodiumalbum(1amb’Squarters)pollen hasbeendescribedasoneofthe majoraeroallergem totheasthmatic patients insunqlqlerandautun'm.At prese衄 we mainly llse pollenextract clinicaldiagnosis sDeci丘cimmunothempy(SIT).Since preparationcontainsamixtt.ffeof allergic nonalle唱enicproteinitmaycauselocaland systemic adversereactions during invivotestsand SIT.Understanding auer黜softhisweed pollen essentialtothe development ofsaferandmoreeffective diagnostic immunotherapeuticreagents.nleaimofthis study Wastoisolateand identify Cbenopodiunlalbum pollen. Chenopodium album pollen extractwas preparedaccording totheconventional procedure.Serumsamples wereobtainedfrom10 Chenopodium-specific allergic asthmatic patients8 non-Chenopodium-specificallergic athmatic patients and6 healthy adults respectively.Biotin-avidinsystem(B胁ELISA Wasusedtotestthe reactivity Chenopodiumalbum pollenalleNen crudeextractproteins werethenisolated gelfiltrationin Sephadex G-100column f1.695cm)and eluted the0.05moI/Lphosphate buffer(pH7.41 at5.0ml/hr/tube.1eelution profile Wasfollowed bymonitoring opticaldensityat280nm.After measuring proteinconcentrationineach p001.thebioactivity Wastested BA—ELISA.nlefractionwithhighest reactivity sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electmphomsis(SDS-PAGE)for furtherisolation andmeasurememofthe molecular weight.AfterSDS-PAGE,protein bandsweretransferred ontonitrocellulosemembraneandthe Chenopodium album pollenmajor allergen(s)Was identified byIefiimmunoblotting. The protein concentrationof Chenopodium album pollen extractwas17.1 mml_Withoptimal loading volume of1.5 ml optimalprotein concentrationof11.4 mIIll,the crudeextmctWaSfractionated bySephadex mainlydividedintotwo fractions.Among thesetwo fractions但T2. PB)and theotherthreefractions pooled fromthebottom parts(PTl,PT2’ PT3’),P12,PT2’and PT3showedthe Igfireactivity pooledalle啦patient sera.After screeningby 10individual positiveserumthe PT2+PT2’ part withareactiverateof 80%(8/1 0)presented highestbioactivityinBA.. ELISA.Atleast10 anti.me bandswithMW ranging from14to43kDaand 66to97kDawas separated fromthecrude Chenopodi啪albumpollen extract SDSj队GE.hlPT2+PT2,.twoprotein bands rang面g from66to97kDa weredetected.Thesetwo proteins exhibitedthesamemolecular weights under nativeandreducedconditionsin SDS-PAGE,which implicated thattheir advancedstructurecontainednosubunitor polypeptide.Oneallergenicprotein nearly68kDain PT2+PT2’fractionWasvisualizedonimmuoblotwith pooledallergicpatientsera.飚protein wasalsofoundtobea majorallergen Chenopodiumalbum pollen becauseits I班bindingfrequency wasover 83%(5/6)in reactionwith aUer西c patient seF'd. In conclusionChenopodiumpollen consistedofmorethan10kinds ofproteins whichhadmolecular weightrangillg from14to43kDa and66to97如a. Thesetwo parts(PT2 PT3)canbewell separatedby SephadexG-100 gel.Thepart highermolecular weightpresented onemajorallergen Chenopodiumalbum pollen Wasdetectedfromthis part. This rrmjorallergen hadaMWof68kDawithnosubunitstructure. Keywords:BronchialasthmaChenopodium album pollenMajorallergen Gel filtrationBA-ELISASDS-PAGEImmunoblotting 支气管哮喘是一种由环境和遗传因素共同决定的疾病,其特征为气道的慢性炎症和气道高反应性。前者的产生主要是由于具有特应性 (atopy)体质的个体在反复接触环境中的过敏原之后,机体对这些过 敏原产生的一系列异常的免疫反应所导致…。所以对过敏原进行研究, 有助于阐明支气管哮喘的发病机理,改进治疗手段。 吸入性变应原是环境中引起支气管哮喘常见的过敏原,它主要分为 两大类,一类为室内吸入性过敏原,如尘螨、屋尘、猫狗皮毛和蟑螂 等;另一类则为室外吸入性过敏原,其中最常见的是各种植物花粉[21。 花粉过敏原的种类很多,不同的地区由于植被的特点引起哮喘的主要 花粉种类也有所不同。但有一些植物分布广泛,抗原性较高,从而成 为不同地区共有的气传性过敏原,藜草花粉就是其中的一种。 藜草(Chenopodiumalbum),俗名灰菜(1amb’squarters),属藜 科(Chenopodiaceae)、藜属(Chenopodium),是一种一年生或多年生 的草本植物,主要生长于荒地、田间和屋旁空地(见附图1)。藜草花 粉靠风媒传播,花粉产量大,每年的7-9月是授粉高峰。该植物花粉外 观类似球形,直径约12—45um,表面具有圆形散孔及分布均匀的短小 刺状纹饰【2卜【4】(见附图2、3)。世界上许多国家都有关于藜草花粉的报 01。在我国,藜草也十分常见,南北各省均有分布,在北京、上海、南京、新疆和广西等地则有关于变态反应性疾病与藜草花粉关系 的报道[2】、[31111'[13J,并认为此种花粉是引起夏秋季哮喘患者主要的变应 原【2Jo 目前在临床上主要使用藜草花粉浸液对病人进行体内外过敏原检测 和特异性免疫治疗(Specifici蛐unotherapy,SIT)。这种花粉粗提 物中含有多种蛋白质成分,其中包含有主要、次要变应原及一些非致 敏性的物质n引。由于变应原成分的存在,当用这种花粉浸液进行体内 试验和sIT时,可能造成高敏体质的病人出现严重的过敏反应;而非 致敏物质的存在可影响试验的特异性和敏感性[151。另外由于缺乏严格 的标准化检测依据,再加上多种因素可影响提取的过程,使得不同批 次的花粉浸液所含变应原成分和浓度均有所差异。运用这种未被定性 和定量的变应原浸液进行临床研究,可造成研究结果间缺乏统一的比 较标准n6】。花粉的主要变应原成分代表了过敏原主要的致敏成分,所 以对藜草花粉变应原进行分析,鉴定出藜草花粉主要变应原,具有一 定的临床意义。 藜草花粉主要变应原的纯化鉴定国内外文献均未见报道。本课题参 照国内外近年较多使用的变应原分离鉴定手段[161-[2引,结合本实验室条 件和设备,采用凝胶过滤法初步分离藜草花粉变应原,运用阳性病人 血清以BA—ELISA检测各分离组份的免疫活性,并通过免疫印迹法 (Immunoblotting)从中筛选出主要变应原,以期为改进诊断和sIT 方法,深入研究藜草花粉与变态反应性疾病关系打下一定的基础。 材料与方法 第—部分:藜草花粉变应原的分离 1.藜草花粉变应原漫液的制备口7】 I材料和设备(1)试剂:、碳酸氢钠、氯化钠和苯酚均为国产分析纯 (2)分样筛(80、100目/英寸2):上海黄浦机箱厂产品 (3)透析袋:截流分子量8000—10000Da,美国进口 (4)TN型托盘式扭力天平:上海第二天平仪器厂产品 (5)752紫外光栅分光光廑计:上海第三分析仪器厂产品 (6)81一z型磁力恒温搅拌器:上海曹行无线)蔡氏(Seitz)滤器:上海医药工程研究院产品;EK滤板:石棉滤板, 德国进口 1.2 方法 (1)花粉采集:藜草开花季节(约8月下旬到i0月中旬)在上海浦东新区、 静安区、闸北区等处的杂草荒地中采集长有藜草花苞的枝条,将待放 花苞置于室内清洁玻璃台板上,24—48小时后花粉自然脱落于台板上, 收集过筛,光学显微镜下检查花粉孢子形态和纯度。 (2)干燥:将藜草花粉置于燥器中3—5天,反复测定重量直至稳定不变。 (3)去脂:称取干燥藜草花粉209,浸泡脱脂。 (4)配制变应原提取液:碳酸氢钠一盐水浸出液(Coca’Ssolution,pH 8.2):氯化钠5.09、碳酸氢钠2.759、苯酚4mi加蒸馏水至1000ml。 (5)藜草花粉变应原的浸出:l:i0(w/v),209去脂干燥藜草花粉加入200ml Coca’S溶液,于4"C浸泡48小时,每日搅拌1—2小时。 (6)澄清:经滤纸常压过滤,除去杂质。 (7)透析:将澄清的提职液放^蒸馏水洗净的透析袋中,置于Coca’S溶液 中4E透析24—48小时,期间经常更换外液,直到透析外液澄净为止。 (8)过滤除茵:于超净工作台中,用蔡氏滤器、EK板、线)无菌试验:将抽滤后的藜草花粉漫液送检细菌和霉菌,分别于37和25观察5天和7天,无细菌和霉菌生长。 (10)藜草花粉变应原浸液蛋白质浓度测定:采用考马斯亮蓝G一250染 色法啪1测定,藜草花粉变应原浸液蛋白质浓虔为1.71mg/ml。 (】1)浓缩:将100ml无菌藜草花粉浸液置于透析袋中,于透析袋周围放 上聚乙二醇20000,浓缩至终体积约10ml,分装后置一20保存,备 为层析用样品,上样前以洗脱缓冲液透析。其余未浓缩部分按lml无 菌分装后置一20 oc保存-。 2.凝胶过滤层析法【29】一【311 2.1材料和设备 (1)试剂:磷酸二氢钠(Nail2P04-2H20):分析纯;磷酸氢二钠(Na2HP04 12H20): 分析纯,均为广东汕头金砂化工厂产品;牛血清白蛋白 (BsA):66,200Da):德国Boehringer公司产品;鸡蛋清溶菌酶 0斜:14,400Da):购自华美生物工程公司 (2)葡聚糖凝胶SephadexG-100(粒度40—120pm):Pharmacia公司产品 (3)层析柱(规格:Z1.6 100cm):上海锦华实验器械厂产品(4)BSZ一100自动部份收集器:上海沪西仪器厂产品 2.2方法 (1)洗脱液:0.05mol/L,pH7.4磷酸缓冲液(PB) a.热溶胀凝胶:称取SephadexG-100 189,置双蒸水中,沸水浴5小时。 b.用数倍洗脱缓冲液充分洗涤凝胶,装柱前温和地将凝胶悬浮于洗脱缓 冲液中,至终体积为填装层析柱床体积的二倍(约380m1), C.对Z1.6100柱,采用下列参数进行层析: 直径:1.6cm;柱长:95cm;体积:190ml;流速:5ml/hr/tube;缓冲 液:0.05mol/L,pH7.4 PB。 d.将层析柱垂直竞起,关闭柱底部出口,加入约1/10柱床体积的缓冲液 后,连续不断地将浆状凝胶注入柱子,静置30min,打开柱底部出口, 调节流速,柱床t保持5cm高的缓冲液柱。检查柱床是否均匀。之后 继续以2—3个柱珠体积的缓冲液平衡柱子。 (3)土样、洗既技组分蛋白质检测:在<10环境下操作。以洗睨缓冲液稀 释藜草花粉浸液。比较不同_V-We扭积、不同上样浓度对藜草花粉变应 原分离的效果。以部份收集器收集洗脱液,5ml/hr/管。紫外分光光度 计测定每管洗脱液光密度值(OD:。0)。以管号为横坐标,光密度值为纵 坐标绘制洗脱曲线)层析分离纽份收集,计算总蛋白回收率:据洗脱曲线分部收集,测定 各部份总体积(、r;),以紫外分光光度法测定蛋白质含量,按以下公式 计算蛋白质浓度(ci)(mg/m1)=1.450D280-0.74OD260【291。计算蛋白质回 收率=【(cixV;)】/(上样浓度X上样体积)。 (5)用聚乙二醇20000浓缩洗4;cf各部份,一20保存备用。 (6)在相同洗既;》件下,洗脱已知蛋白(牛血清白蛋白6.67mg/ml+鸡蛋清 溶菌酶6.67mg/m1)混合液,以估计未知样品分子量。 第二部份:凝胶过滤层析纽分生物学活性测定和藜草花粉主要变应原的鉴 1.生物素亲和素一酶联免疫吸附分析法mA—ELISk)检测藜草花粉血清特异性IgE(slgE)反应条件的确立【32】’【埘 1.1材料和设备 (1)主要试剂:生物素化马抗人IgE多抗(Biotin-HkHIgEPcAb)、亲和素 一辣根过氧化物酶结合物(A-HRP)均购自上海江南生物技术工程有限公 司;邻苯二胺(OPD):上海五联化工厂产品 (2)40孔聚苯乙烯酶标板:天津有机玻璃制品厂产品 (3)电热恒温水温箱:上海跃进医疗器械厂产品 (4)5000型酶柏赦:联娥光学仪器厂产品 1.2方法 (1)配制试剂: a.包被液(碳酸盐缓冲液,pH9.6):碳酸氢钠0.299,碳酸钠0.169溶解于 00ml双蒸水中,4保存两周b.洗涤液(磷酸盐缓冲液一吐温20,pH7.4,PBST):磷酸二氢钠 (Natt2P04.2H20)2.99,氯化钾0.29,磷酸二氢钾O.29,氯化钠89,吐温一 20 0.5ml,加水定容至1000ml c.稀释液:含3%牛血清白蛋白的PBST(也作为封闭:糊 d.底物液:磷酸氢;钠(Na2ltPO_4.12H20)1.849,柠檬酸3.629,加水至100ml。 临用时每10ml底物液加入OPD 4mg和30%H202159l e.终止液:2mmol/L硫酸:容液 (2)操作步骤: 结果 第一部份:藜草花粉变应原的分离 参考其他已知花粉天然变应原的分子量大小。81(附表1),发现多数变 应原的分子量在lO一100kDa之问,故选用_T-作范围在O.4-150kDa的葡聚 糖凝胶SephadexG-100t2町作为藜草花粉变应原初步分离之用。 lI Sephadex G-1 00层析分离藜草花粉变应原条件的确定 1.1不同上样体积对SephadexG-100层析效果的影响 以平衡缓冲液稀释浓缩后的藜草花粉浸液至蛋白质浓度8.55mg/ml。 改变上样体积,观察不同上样体积对SephadexG-100分离藜草花粉变应 原的洗脱曲线)的影响, 确定最佳上样量为1.5ml。 表1.1上样体积与总蛋白回收率的关系(上样浓度:8.55mg/m1) (Tab 1.1Therelationofdifferent loading volumeand yielding rateoftotal protein) 上样体积上样蛋白洗脱峰(PT)、谷(PT’)收集部份蛋白含总蛋白回收 (m1) 总量(mg) 量(mg) !12112: !13:2.O 17.1 0.15 2.14 0.40 8.57 65.861.5 1.0 O.575 12.8 8.55 4.92 O.35 4.24 0.53 5.44 0.1l 79.19 0.076 1.27 0.78 4.42 O.590.7l O.71 26.461.2不同上样浓度对凝胶过滤层析的影响 用平衡缓冲液将浓缩的藜草花粉浸液稀释成不同浓度(17.1、11.4、 8.55和5.7mg/m1),以最佳上样体积1.5rnl上样进行层析,比较洗脱曲线)。确定最佳上样浓度为11.4mg/ml。 14 理35 嚣n115婪0.1 0.05 15Q2 Q18 一Q16 篇Q14 采Ct05Q04 J=I撇8.5知g/ml,上市懈o.575ml,蛋白唾冶量4.9扫g图1.1不同上样体积对Sephadex G-100层析分离藜草花粉变应原效果的影响 (Fig 1.1Effectofdifferent loading volumetotheresolutionof Sephadex G-100in isolatingChenopodium album allergens) E样体积:A-2ml、B-1.5ml、C-1.Oml、D_0.575m1 16 倒Q15婆Q1 磷镪渡11.堍酵泓积1.锄,蛋白质镗17.崦17 Q35 n3 图1.2不同上样浓度对SephadexG-100层析分离藜草花粉变应原效果的影响(Fig 1.2Effectofdifferent loading concentrationtotheresolutionof Sephadex G-100in isolatingChenopodium album allergens) 上样浓度:A-17.1mg/ml、B-11.4mg/ml、C-8.55mg/ml、D-5.7 mg/ml 18 表1.2上样浓度与总蛋白回收率的关系(上样体积:1.5m1) (Tab 1.2Therelationbetweendifferentconcentration ofloadingsample yieldingrateoftotal protein) 1.3已知分子量蛋白洗脱曲线) Sephadex G-1 00将藜草花粉浸液中的变应原主要分离成2大部分。 根据相应已知分子量蛋白质的洗脱曲线,粗略估算藜草花粉蛋白洗脱第 一峰所含蛋白分子量约在66,000Da以上,第二峰所含蛋白分子14,000Da 上下。 0.70.6 图1.3已知蛋白洗脱曲线ElutioncurveofknownMW proteins) A.bovineserum albumin,MW 66kDa Bhen egg white lysozyme~MWl4kDa 19 第二部份:凝胶过滤分离组分生物学活性测定和藜草花粉主要变应原的 鉴定 1.生物素亲和素一酶联免疫吸附分析法(BA—ELISA)检测藜草花粉血清 特异性IgE(sIgE)反应条件的确立 首先,藜草花粉变应原以17.199/ml浓度包板,生物素化抗体及酶 表亲和均1:30稀释,血清按1:5、1:i0、1:20、1:40、1:80倍比稀释, 所得反应曲线。根据该曲线D值较高、OD阳性枣者血清/0D 阴性楷血清大于或等于2.0的血清稀释度,确定1:5为最佳血清稀释度。 之后,逐一改变生物素化抗体、酶标亲和素和抗原包被浓度,经相应反 应曲线)确定BA—ELISA反应最佳条件分别为:抗 原包被浓度1 7.1“g/ml,生物素化抗体稀释度l:30,酶标亲和素l:50。 2.BA-ELISA检测层析后各组份的生物学活性 以最适上样条件层析分离的洗脱液按洗脱曲线个部分: PTl,PT2,PT2’,PT3。各纽份以包被液稀释至约30Iag/ml,分别包板。不 同组份与混合阳性血清、混合阴性血清和健康人混合血清首先反应,结 果(表2.1)显示PT2,PT2’,PT3组份有生物学活性。 表2.1已知混合血清与层析各组份BA-ELISA结果 (Tab2.1BA-ELISAresultoftheelutionfractions byusingpooled sera) {以P/N>2.0为反应阳性 20 1/101/20 l/40 1/S0 I+阳性参考血清 O.557 4690.229 0.179 0,18 (0D492) I—I_.9{.I生誊考血清 0.181 2320.t24 O.097 0.101 (0D492) 血清稀释度 图2.1不同血清稀释度的BA-ELISA反应曲线 ThereactioncurveofdifferentdilutedserumlevelinBA-ELISA) 1/15l/30 1/50 1/75 1/100 —一阳性参考血清 0.473 0.469 0.229 0.179 O.18 (OB492) 『—-一阴性参考血清 0.193 0.168 0.124 0.097 0.101 (00492) Blot in—HAHIgBPcAb稀释度 图2.2不同生物素化马抗人IgE抗体稀释度的BA—ELISA反应曲线Thereactioncurveofdifferentdilutedlevel ofbiotin-HAHIgE PcAbinBA-ELISA) 21 1/151/30 1/50 l/75 1/100 睦参考血清0.504 0.467 0.469 0.176 0.231 (01)492) f+阴性参考血清 O.22 0.215 0.173 0.071 0.133 (OD492) Avidin—HRP稀释度 图2.3辣棵过靼I化物酶标记亲和素不同稀释度的BA-ELISA反应曲线Thereacdoncurveofdifferemdilutedlevelofavidin-HRPinBA- EUSA) U.O 0.3《0.2 羹0.1 34.217.1 8.55 4.28 2.14 —+一阳性参考血清 0.550 0.547 0.297 O.121 0.100 (0D492) 一阴性参考血清0.211 0.170 0.119 0.060 0.070 (00492) 藜草花粉包被抗原浓庹(ug/m1) 图2.4不同藜革花粉包被抗原浓度的BA-ELISA反应曲线Thereactioncurveofdifferent coating concentration ofChenopodium pollen extractinBA-ELISA) 以PT2+PT2’及PT3分别再次包板艨,并与个别阳蛀焱渍葶口个别职性血 清反应。以阳性血清oD值/平均阴性血清OO值2.0为反应阳性。结果(表 2.2)10份阳性病人血清中有8份可与PT2+PT2’部分反应,2份与PT3部 分反应,提示PT2+PT2’部分含有藜草花粉主要变应朦。 表2。2已知令人黟矬盘潦与誊洗脱纽_玲B^缱l。lsA翡果 (Tab 2.2TheresultofBA-ELISAb蛳veenelutionfraction andtheindividualserum sample) 血清PT2+PT2’PT3 编号 阳性组 阴性组 0.6060。202 2。97 0.432 0。203 2.02 0+4810.181 2.36 0。41 0.189 1.92 0.3750.233 1.84 0.415 0.223 1.94 0.4380.2 2.15 0.369 0。18I 1.72 0,5220.198 2,56 0.374 0.239 1.75 0.6570.26 3.22 0.337 0.186 1,57 0+2840.171 1.39 0.171 0.125 0.80 0。6060.187 2+97 0。393 0.26 1.84 0.5112.50 0.432 2.02 10 0。493 2.42 0.403 t.88 Nl母为Ni夔挂红血清乎麓蛾2经=。204 N2.5套N2阴性鲤血清乎均O玟92值,O。201 3.SnS呻AGE检测具生物学活性屡析组分纯度 通过SDS-PAGE,藜草花粉浸液缀层析组份(PT2+PT2’)可分离出多 条蛋白带。在lo份离Ji睽_条件下,藜革花粉浸液中一l、于40kDa的蛋白质分 离较姆£器3。la),彝在12撼分寒胶条件-F,太子40kDa畿蛋白壤列较清 楚的被分离(图3.1b), 可见藜草花粉浸波含有至少lO种第同分子赞大 小的蚕白质。经SepadexG一100分离出的PT2+PT2’组份则主要含有2奈蛋 白带,分子量在66-97kDa之间;PT3组份(图3.1c)阶参蛋白质在12%分 离较条停下分离不很清楚,但集中在40kDa以下。 图3.18--C藜草花粉漫液和洗脱后组份(PT2+PT2’,PT3)SDS-PAGE结果fFig3.1a-c SDS.H蝣E analysisofChenopodium albumextract andeluted fraetions(PT2+PT2’,PT3)) Lane al,bl,cl:moleeulal"weight markers fA:97,B:66,C:43,D:31,E:20,F:14.4ld)a) Lanea2.b2:ChenopodiumalbumextractseparatedbySDS.Pf~GEunder 10%(a2)and12%(b2)acrylamideresolvinggel Lanec2,c3:PT2十PT2’(c2)andPT3(c3)eluted fractionsin12% acrylamideresolvinggel 4.免痰印迹分析法(Immmoblot ing)筛选鉴定藜草花粉主要变应原所谓主要变应原是指致敏物质所含多种变应原中能与50%病人反 应的单一蛋白质D91。藜草花粉变应原经层析分离得到的PT2+PT2’组份 在经变性电泳后半干转移到Nc膜上,分别与混合阳性血清和混合阴性 血清反应,结果与混合阳性血清反应的NC条上出现条阳性条带,与阴 性混合血清反应的Nc条未见阳性结果(见图4.1a)。6份阳性血清和 6份阴性血清分别与附有PT2+PT2’蛋白组份的NC条反应,结果与6份 阳性血清反应的Nc条中有5条在相应位置上出现一条蛋白质带(图 4.ib),而与阴性血清反应的6份Nc条中均未见蛋白质带。该结果结合 电泳凝胶染色的标准分子量蛋白带提示上面能与83.3%(5/6)阳性血 清反应的蛋白质分子量约为68,000Da;观察未变性样品与变性样品在 SDS—PAGE后的分离条带,发现结果相似(见图4.2),提示此蛋白质不 具有亚基结构。 97—} 660 43j 3l—+ 20—' 14—’ 图4.1PT2+PT2,免疫印迹部分结果 fFig 4.1 PartialresultsofPT2+PT2’in IgEimmunoblotting) Lane1:PT2十]P|T2’fractionreactedwith pooledallergicpatmm sera Lane2:PT2+PT2’fractionreactedwith poolednon.allergicpatient sera Lane3-8:F12+PT2’fractionreactedwith6individual allergic patient serum 图4.2 PT2+PT2’组份在非变性与变性条件下SDS-PAGE结果比较 (Fig4.2SDS-PAGEresultsofPT2+PT2’undernative andreducedconditions1 Lane乱b:nativePT2十P呵2’ Lanec.d:reducedPT2+PT2’ Lanee:molecularweightmarkers 讨论 藜草花粉是引起支气管哮喘的一种重要的吸入性过敏原。该植物在我 国广泛分布,其花粉是暖温带(如北京、江苏北部),温带荒漠(如新疆) 环境中组成夏秋季孢粉谱的主要种类”】,在上海地区对藜草花粉过敏的哮 喘患者也很多,以这种花粉浸液进行皮肤挑刺试验的阳性率仅次于粉尘螨 和屋尘,为多种受检花粉过敏原之首“”。目前仅有较少的关于它和其他属 植物花粉的交叉反应性研究“1]’【4“,因此对藜草花粉变应原有进一步研究 的必要。 开展花粉主要变应原研究首先应对花粉变应原进行分离,以获得相对 纯化的成份。近年来国内外对过敏原中主要变应原的分离鉴定使用过多种 方法[1目_f2副。由于凝胶过滤法具有分离条件温和,重复性好的优点,同时 无需特殊设备,因此本实验采用凝胶过滤法对藜草花粉变应原进行初步分 1.Scphadex6-1 00过滤分离藜草花粉变应原 Sephadex G-1 00属于葡聚糖凝胶系列,具有分子筛效应,对于球状 蛋白质其工作范围主要在4000-150000Da。为获得较高的分辨率,本实验 选用岳析柱长(L)/直径(D)>40的层析柱,除此之外,影响凝胶县析效 果的主要因素还有E样体积和上样粘度,所以比较在不同的上样体积和上 样浓度下的层析效果和总蛋白质回收率以获得最佳上样条件。 上样体积大小可影响组份分离的程度,这是因为当样品体积等于或大 于相邻两物质洗Jljf,f敞之差(即分离体积)时,两相邻纽份不能完全分离, 同时在实际操作中由于总是有区带扩散的现象,所以只有当样品体积适当 小于分离体积时,两相邻组份才能得到分离。但由于对藜草花粉组成完全 未知,所以应尽量减少上样体积,以获得较好的分离效果。对于分析}生层 析,一般选用体积为-4%柱.gg积的上样体积进行层析n91。本层析柱柱 床体积190cm3,以3ml(占柱床体积1.5%)和2ml(占柱床体积1.O%)上 样时,前者产生的洗脱峰重叠明显(结果未列出),后者层析峰之间则分 离的较开。之后在固定蛋白浓度条件下又比较了4个E样体积(2、1.5、 1.0和0.57m1),随上样体积的减小,2个主要的洗脱峰重叠程度有所减少, 但总的分辨率并无明显差别。上述4个上样体积仅占柱床总体积的0.26%一 1%,与洗脱曲线ral相比,明显小于该值,所以两 峰较好地被分离。但曲线也提示有一些未被很好分辩的蛋白峰,可能是因 为在较长的洗脱过程中,小分子量的蛋白质产生扩散,或是由于蛋白质分 子量接近,所以无法很好地被此层析介质所区分。在结合后续蛋白分析的 要求,高的总蛋白回收率在分离效果无明显差.-54的情况下,是选择最适上 样体积的依据。 以不同样品浓度、相同上样体积上样时,结果与理论相符,即E样蛋 白浓度对层析效果影响不大[301,但不同洗脱曲线问有些细小差异的存在: 样品浓度越高,第二峰拖足越明显;在17.1mg/ml蛋白浓度下,原有第一 峰的位置出现二个相互重叠的洗脱峰,提示第一峰含有混合的蛋白质成 分;在5.7mg/ml蛋白浓茛条件下,洗Jijf烽变低、两峰重叠部分增大,显 示柱分辨率有所下降。藜草花粉浸液较粘稠,是造成拖黾现象的原因之一, 而蛋白分子的扩散,是造戍洗脱时间延长的可能原因。 另外,在洗脱体积近似外水体积的范围内,有一光密度值很低的小峰 T1部分),经紫外光吸收法检测发现含有极微量的蛋白。这组物质可能是一组分子量极大但含量极低的蛋白质,但也不能排除是检测的误差或 只是一些无关的杂质。 SephadexG-100作为藜草花粉变应原的分离介质,可以将该花粉中分 子量差别较大的蛋白质分开,且分离条件温和,重复性好。但单纯以此方 法纯化藜草花潮噪一变应原是不够的。 2.BA—ELISA方法的建立及层析后各纽份的生物学活性橙嘲1 酶联免疫分析运用固相抗原(抗体)系统,可将游离和结合的酶标记 物迅速分离开,所以载体撇坏,直接关系到检测结果。在ELISA反应 中固相结合的蛋白质总量最好大大多于待检测的物质,但包被抗原浓度过 高时,会造戍多层吸附,影响ELISA的重复陛;浓度过低时,载体上非特 异的吸附增加,可降低测定的灵敏度弄口特异性【3引。在此实验中最佳包被抗 原浓度为I 7.1g/ml,对于仅占血清免疾球蛋白总量0.002%的血清IgE (7-45ng/m1)H”应是过量的,血清在1:5稀释之后总IgE含量仅为1.2- 9ng/ml,即使特异性IgE含量增高,也已接近ELISA最低检测范围。所以 血清稀释度不能太大。 抗原与抗体的结合能力反映的是变应原生物学活性的一个方面,即免 癌艮应性。目前大多数变应原的生物学活性检橛4多通过ELISA法及放射变 应原吸附试验(radioallergosorbenttest,RAST)[441-[46]。ELISA法灵

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